【重難點突破】
一、如何理解固定化酶的作用和原理？
1．酶的催化活性依賴于酶的空間結構及活性中心。所以在固定化要選擇適當條件，力圖不使其活性中心的基團受到影響。
2．酶固定化的方法很多，目前采用的固定化技術大致可分為三類：載體結合法(包括共價鍵結合法、離子結合法、物理吸附法)、交聯法和包埋法。上述幾種方法也可并用，稱為混合法。
(1)載體結合法：利用共價鍵、離子鍵和物理吸附法把酶固定在纖維素、瓊脂糖、多孔玻璃和離子交換樹脂等載體的固定化處。
(2)交聯法：交聯法是利用雙功能試劑的作用，在酶分子之間發生交聯，凝集成網狀結構而制成的固定化酶。酶蛋白中的游離基團(如氨基、巰基等)可參與交聯反應。
(3)包埋法：包埋法是將酶包埋在聚合物凝膠的微細網絡中或被半透性的聚合物膜所包圍，使酶分子不能從凝膠的網絡中或膜中漏出，而小分子的底物和產物則可以自由通過凝膠網格和半透膜。
3．固定化酶應用實例
將葡萄糖異化酶固定在果顆狀載體上→放入底部有許多小孔的反應柱(酶顆粒不能通過，反應液能通過)→葡萄糖溶液從反應柱上端注入→流經反應柱→與葡萄糖異構酶接觸→果糖從反應柱下端流出。
4.對固定化酶的理解：可以使反應過程管道化、自動化，產物易從反應液中回收；酶的穩定性有所改進；酶的使用效率提高。
【典題演示1】
1. (2010蘇南四市一模)固定化酶是從20世紀60年代迅速發展起來的一種技術�？蒲腥藛T用海藻酸鈉作為包埋劑來固定小麥酯酶，以研究固定化酶的相關性質和最佳固定條件。酶活力為固定化酶催化化學反應的總效率，包括酶活性和酶的數量。下圖甲、乙、丙為部分研究結果。下列有關敘述中，錯誤的是
A．由甲圖可知，固定化酯酶比游離酯酶對溫度變化適應性更強
B．由乙圖可知，濃度為3%的海藻酸鈉包埋效果最好
C．由丙圖可知，固定化酯酶一般可重復使用3次，之后若繼續使用則酶活力明顯下降
D．固定化酶的酶活力較高，主要原因是增加了酶與底物的接觸面積
【答案】D
【解析】正確掌握固定酶的特性和識別圖形是突破口。甲圖可以看出在50度時游離酶的活性已經很低，但是固定酶的活性依然很高，可以判定固定酶的溫度適應范圍廣；乙圖反應的時海藻酸鈉的濃度與酶活力的關系，可以看出濃度為3%時，酶活力最高；丙圖可以看出使用三次以后酶活力明顯下降；固定化酶與底物的基礎面積減少。
【變式訓練1】
1. 下列不屬于固定化酶在利用時的特點的是 （ ）
A．有利于酶與產物分離
B．可以被反復利用
C．能自由出入依附的載體
D．一種固定化酶一般情況下不能催化一系列酶促反應
【答案】C
【解析】掌握固定酶的知識時突破口。固定酶是把酶固定在特殊材料上，不能自由出入依附的載體。
【變式訓練2】（09江蘇高考生物）下列關于固定化酶和固定化細胞的敘述，正確的是（ ）
A．固定化細胞技術在多步連續催化反應方面優勢明顯
B．固定化酶的應用中，要控制好pH、溫度和溶解氧
C．利用固定化酶降解水體中有機磷農藥，需提供適宜的營養條件
D．利用固定化酵母細胞進行發酵，糖類的作用只是作為反應底物
【答案】A
【解析】本題對固定化酶和固定化細胞進行發散考查，固定化酶發揮作用，與溶解氧無關，B選項錯；固定化酶不屬于生物，不需要提供營養，而固定化細胞進行生命活動，是需要營養的，C選項錯；糖類既是酵母菌作用的底物，也是微生物培養所需碳源。
【變式訓練3】、下列有關固定化技術的敘述，正確的是（ ）
A．固定化酶只是在細胞內才能發揮作用 B．固定化酶能提高酶的利用率
C．酶的固定是酶分離純化的常用方法 D．固定化酶的固定化方式就是吸附在固體表面上。
【答案】B
【解析】本題主要考查固定化酶的相關知識�？季V中的能力要求是A級。理解固定化技術的原理及優點是本題的解題突破口。制成固定化酶的步驟是：酶的生產、提取、酶的分離純化、酶的固定化，制成固定化酶的方法有吸附在固體表面，有將酶相互連接起來．將酶包埋在細微的網格里等；這樣的固定化酶能重復利用，從而提高了酶的利用率；而酶在條件適宜時，既可在細胞內起作用，也能在細胞外起作用，制成的固定化酶，更是主要在細胞外發揮作用。
二 如何理解固定化細胞的作用和原理？
1、固定化微生物細胞利用微生物來生產酶，具有生產成本低、周期短、產量大等優點。微生物產生的酶，可以分為分泌在細胞外的胞外酶和包含在細胞內的胞內酶。利用胞內酶時，需要采用手段將細胞破碎后，將酶進行分離純化，提取后酶的活性和穩定性往往都受到很大的影響。
將微生物細胞限制或定位于特定空間位置，即將微生物制成固定化細胞后，既能避免復雜的細胞破碎、酶的提取和純化過程，又能使酶的活性和穩定性得到較大提高。固定后的微生物細胞可以作為固體催化劑在多步酶促反應中發揮連續催化作用，同時，催化反應結束后又能被回收和重復利用。優點：制備容易、酶的活性高且穩定。
2、固定化活細胞的制備主要方法：包埋法。將微生物細胞用物理方法包埋多微也載體內部。凝膠包埋是最常用的方法，凝膠種類有瓊脂、海藻酸鈉（鈣）、角叉菜聚糖、明膠和聚丙烯酰胺凝膠。
目前常用海藻酸鈣包埋法，其基本原理是：先將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把細胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中(常用CaCl2溶液)，使海藻酸鈉中Na+的部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯的離子網絡凝膠。這種方法操作簡便，條件溫和，對細胞無毒性，適合于生長細胞的固定化。但磷酸鹽會使凝膠結構破壞，在使用時應控制好培養基中磷酸鹽的濃度，并要在培養基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結構的穩定性。
3、比較直接使用酶、固定化酶和固定化細胞催化的優缺點。
類型優點不足
直接
使用酶催化效率高，低耗能，低污染對環境非常敏感，易失活；難回收，不能再次利用，與產物混在一起，可能影響產品質量
固
定
化
酶(1)極易將固定化酶與底物、產物分開；產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。
(2)可以在較長時間內反復使用，有利于工藝的連續化、管道化。
(3)酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化和微電腦化。
(4)在絕大多數情況下提高了酶的穩定性。
(5)較能適應于多酶反應。
(6)酶的使用效率提高，產物得率提高，產品質量有保障，成本低。(1)酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。
(2)比較適應水溶性底物和小分子底物。
(3)與完整細胞比較，不適于多酶反應，特別是需要輔因子的反應，同時對胞內酶需經分離后，才能固定化。
（4）一種酶只能催化一種化學反應，生產實踐中，很多產物的形成是通過一系列的酶促反應得到的。
固
定
化
細
胞(1)省去了酶的分離手續．為多酶系統，無須輔因子再生。
(2)細胞生長快、而且多、反應快。
(3)可以連續發酵，節約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞，能一邊徘出發酵液，一邊進行培養，排除了產物抑制和消耗。
(4)保持酶在細胞內的原始狀況，增加了酶的穩定、特別是對污染因子的抵抗力增加。(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產品純度。
(2)必須防止細胞內蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內其他酶的活性止副產物的形成。
(3)細胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散。
【典題演示2】
1. 下列說法不正確的是 （ ）
A．葡萄糖與固定化葡萄糖異構酶接觸，轉化成的是果糖
B．從固定化酶反應柱下端流出的是果糖
C．高果糖漿不會像蔗糖那樣誘發肥胖、糖尿病、齲齒和心血管疾病
D．酶溶解于葡萄糖溶液后，可從糖漿中回收
【答案】D
【解析】正確區別固定化酶與酶制劑是關鍵。葡萄糖異構酶催化葡萄糖轉化為果糖；在反應柱上方流進葡萄糖溶液，下方流出果糖；果糖和蔗糖相比較具有很多優點；酶不會溶解在反應液中，因為它被固定在載體材料中。
【變式訓練4】
1.關于固定化酶和一般酶制劑在應用效果上的說法錯誤的是 ( )
A．固定化酶生產活性強，可長久使用
B．一般酶制應用后和產物混在一起，產物的純度不高
C．一般酶制劑參加反應后不能重復利用
D．固定化酶可以反復利用，降低生產成本，提高產量和質量
【答案】A
【解析】區分固定化酶與酶制劑是本題的解題突破口。該題主要考查了固定化酶的優點，即應用后易與產物分離，提高產品質量；可以反復利用，降低生產成本。但是固定化酶作為生物催化劑，具有一定的生物活性。隨著時間的推移，酶的活性會降低，甚至消失，即固定化酶不能長久使用。例如：生產高果糖漿的固定化酶一般只能連續使用半年。
【變式訓練5】試分析下圖中，哪一種與用海藻酸鈉作載體制備的固定化酵母細胞相似（ ）
【答案】D。
【解析】本題主要考查酶固定和細胞固定的相關知識�？季V中的能力要求是A級。區分酶固定和細胞固定的方法是本題的解題突破口。解析過程：A是吸附法，常用于將酶固定；B是載體結合法多用于酶的固定；C和D是包埋法，C一般是將酶包埋在微網絡里，D是包埋在凝膠中。制備固定化酵母用的是包埋法，即將酵母菌包埋在海藻酸鈉制成的凝膠中，所以與D相似。
三 制備固定化酵母細胞并進行酒精發酵
1.制備固定化酵母細胞流程
2.制備固定化酵母細胞主要操作過程
（1）酵母細胞的活化。在缺水的狀態下，微生物會處于休眠狀態�；罨褪亲屘幱谛菝郀顟B的微生物重新恢復正常的生活狀態。酵母細胞所需要的活化時間較短，一般需要O．5～1 h，要提前做好準備。此外，酵母細胞活化時體積會變大，因此活化前應該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細胞的活化液溢出容器外。
（2）海藻酸鈉溶液的配制和使用：對海藻酸鈉溶化時要用小火或間斷加熱，避免海藻酸鈉發生焦糊；溶化后先冷卻至室溫，再與酵母細胞混合，避免高溫殺死酵母細胞；固定化酵母細胞時，應將海藻酸鈉酵母細胞的混合液用注射器緩慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注射。海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細胞的質量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細胞的數目少影響實驗效果。
（3）CaCl2的作用是使海藻酸鈉膠體發生聚沉，形成凝膠珠。剛形成的凝膠珠應在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩定的結構。
（4）凝膠珠的檢測：穩定30min以后，一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手擠壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠制作成功。二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。
【典題演示3】1．（2010江蘇）右圖1表示制備固定化酵母細胞的有關操作，圖2是利用固定化酵母細胞進行酒精發酵的示意圖。下列敘述正確的是
A．剛溶化的海藻酸鈉應迅速與活化的酵母菌混合制備混合液
B．圖1中X溶液為CaCl2溶液，其作用是使海藻酸鈉形成凝膠珠
C．圖2發酵過程中攪拌的目的是為了使培養液與酵母菌充分接觸
D．圖1中制備的凝膠珠用蒸餾水洗滌后再轉移到圖2裝置中
【答案】BCD
【解析】正確掌握準備固定酵母細胞的方法和意義是關鍵。搞清固定過程所涉及的材料，明確酒精發酵的流程及操作意義。
【變式訓練6】
1、（09屆鹽城市摸底）下列有關固定化酵母細胞制備步驟正確的是 ( )
A．應使干酵母與自來水混合并攪拌，以利于酵母菌活化
B．配制海藻酸鈉溶液時要用小火間斷加熱的方法
C．向剛溶化好的海藻酸鈉溶液中加入已活化的酵母細胞，充分攪拌并混合均勻
D．將與酵母細胞混勻的海藻酸鈉液注入CaCl2溶液中，會觀察到CaCl2溶液中有球形或橢珠形的凝膠形成
【答案】B。
【解析】本題主要考查固定化酵母細胞的相關知識�？季V中的能力要求是B級。掌握固定化酵母細胞的方法和步驟是本題的解題突破口。解析過程：由于在缺水狀態下，微生物處于休眠狀態，為了加速酵母細胞的活化，將干酵母與蒸餾水混合后應用玻璃棒充分攪拌。為避免海藻酸鈉發生焦糊，溶化時要小火間斷加熱。如果將剛溶化好的海藻酸鈉與已活化的酵母細胞混合，有可能會殺死酵母細胞。將與酵母細胞混勻的海藻酸鈉用注射器緩慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注入。
【變式訓練7】.（2009通州調研）固定化酶是從20世紀60年代迅速發展起來的一種技術。東北農業大學科研人員利用雙重固定法，即采用戊二醛作交聯劑（使酶相互連接），海藻酸鈉作為包埋劑來固定小麥酯酶，研究固定化酶的性質，并對其最佳固定條件進行了探究。下圖顯示的是部分研究結果（注：酶活力為固定化酶催化化學反應的總效率，包括酶活性和酶的數量），分析回答：
（1）從對溫度變化適應性和應用范圍的角度分析，甲圖所示結果可以得出的結論是______。
（2）乙圖曲線表明濃度為________的海藻酸鈉包埋效果最好，當海藻酸鈉濃度較低時，酶活力較低原因是___________。
（3）固定化酶的活力隨使用次數的增多而下降，由丁圖可知，固定化酯酶一般可重復使用______次，酶活力明顯下降。
（4）固定小麥酯酶不采用海藻酸鈉直接包埋，同時用戊二醛作交聯劑，這是因為_______。
【答案】（1）固定化酯酶比游離酯酶對溫度變化適應性更強且應用范圍較廣 （2）3% 海藻酸鈉濃度較低時包埋不緊密，酶分子容易漏出，數量不足 （3）3 （4）酶分子很小，很容易從包埋材料中漏出
【解析】理解利用固定化酶的制作、工作原理、優缺點是解決本題的突破口。固定化酶應用后易與產物分離，提高產品質量；可以反復利用，降低生產成本。但是固定化酶作為生物催化劑，具有一定的生物活性。隨著時間的推移，酶的活性會降低，甚至消失，即固定化酶不能長久使用。
【備用】3.（09江蘇卷）酶解法制備原生質體的原理是利用酶溶液對細胞壁成分的降解作用。蝸牛酶液從蝸牛（以植物為食）消化腺中提��；果膠酶、纖維素酶從微生物中提取。為了研究不同酶液的酶解效果，某實驗小組取無菌煙草幼葉，切成相同大小的小片，等量放入6支試管中，試劑用量和實驗結果列于下表。請回答有關問題。
試管編號
項目IⅡⅢⅣVⅥ
蒸餾水（mL）2O1111
緩沖液（mL）0210.50.50.5
果膠酶液（mL）O0O0.5O0
蝸牛酶液（mL）O0OO0.50
纖維素酶液（mL）0O0O00.5
實驗結果（綠色深淺程度）－－－+++++++++
（注：“+”越多表示綠色越深，“一”表示顏色無顯著變化）
（1）實驗過程中，需要輕搖試管，其目的是 ，使原生質體從葉小片中游離出來，以便觀察懸浮液綠色的深淺。
（2）從綠色的深淺可推測：蝸牛酶液酶解效果最好，原因是蝸牛酶液含有 等多種酶。該實驗中 是空白對照組，其設置意義是 。
（3）用網篩過濾原生質體到離心管內，離心后收集沉淀物，并用 洗滌。
（4）原生質體是否符合要求還需進行檢驗，其檢驗的方法是 。
【答案】（1）為了使細胞壁與酶充分接觸，提高酶解效果（2）果膠酶和纖維素酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 排除無關變量的干擾 （3）等滲溶液 （4）低滲漲破法
【解析】本題考查有關酶的催化效率的實驗，（1）實驗過程中，需要輕搖試管，可以使細胞壁與酶充分接觸，可以提高酶解效果（2）蝸牛以植物為食，所以唾液酶中含有果膠酶和纖維素酶，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ沒有添加酶溶液為空白對照組。其目的是排除無關變量的干擾。（3）離心后收集沉淀物，并用等滲溶液清洗，目的是保持細胞正常形態。（4）要用低滲漲破法來檢驗原生質體是否符合要求，若沒有細胞壁則可以漲破，有則不能漲破。
【總結提升】
1、固定酶的方法可分為三類：載體結合法(包括共價鍵結合法、離子結合法、物理吸附法)、交聯法和包埋法。
2、固定酶的優點：可以重復多次使用，和反應物分離提純容易。
3、固定酶的缺點：只能催化單一反應，固定過程會對酶的活性產生影響。
4、固定細胞的方法：包埋法，用海藻酸鈉包埋。
5、海藻酸鈉小火融化防止燒糊，酵母菌要加水活化，溶化的海藻酸鈉要冷卻至室溫加入活化的酵母菌攪拌均勻。
6、CaCl2的作用是使海藻酸鈉膠體發生聚沉，形成凝膠珠。
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