【高考目標定位】
1、蛋白質的提取和分離
2、PCR技術的基本操作和應用
【考綱知識梳理】
一、DNA的粗提取與鑒定
1、實驗原理：DNA與雜質的溶解度不同，在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14mol/l的NaCl溶液中溶解度最低。
2、實驗設計：
①實驗材料的選取：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。
②破碎細胞：動物細胞的破碎比較容易，以雞血細胞為例，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。
③去除濾液中的雜質：利用DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，控制NaCl溶液的濃度去除雜質。
④DNA的析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會出現白色絲狀物，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。
⑤DNA的鑒定：取兩支20ml的試管，各加入物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑�；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜�5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍。
二、多聚酶鏈式反應擴增DNA片段
1、PCR原理：DNA的熱變性
2、PCR反應過程：一般要經歷三十多次循環，每次循環可分為變性→復性→延伸三步。
3、PCR技術中控制不同溫度的意義
（1）90℃以上時變性，雙鏈DNA解聚為單鏈；
（2）50℃左右時復性，兩種引物與兩條單鏈DNA結合；
（3）72℃左右時延伸，TaqDNA聚合酶促使DNA新鏈的合成。
三、血紅蛋白的提取和分離
1、方法及原理
方法原理
凝膠色譜法根據相對分子質量的大小分離蛋白質
電泳法各種分子帶電性質的差異以及分子本身大小、形狀的不同來分離蛋白質
2、操作程序：
（1）樣品處理：
紅細胞的洗滌→血紅蛋白的釋放→分離血紅蛋白溶液
（2）粗分離??透析：除去樣品中相對分子質量較小的雜質。
（3）純化：一般采用凝膠色譜法對血紅蛋白進行分離和純化。
（4）純度鑒定：一般用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法來測定蛋白質的分子量，即對血紅蛋白進行純度鑒定。
3、細胞內DNA復制與PCR技術的比較
細胞內DNA復制PCR
不同點[高考資源網]解旋在解旋酶作用下邊解旋邊復制80℃~100℃高溫解旋，雙鏈分開
酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶
引物RNADNA或RNA
溫度體內溫和條件高溫
相同點（1）需提供DNA復制的模板
（2）四中脫氧核苷酸作原料
（3）子鏈延伸的方向都是從5?端到3?端
（4）都需要酶的催化
【要點名師精解】
一、DNA粗提取中注意事項
1、實驗過程中兩次用到蒸餾水，第一次目的是使成熟的雞血細胞漲破釋放出DNA，第二次目的是稀釋NaCl溶液，使DNA從溶液中析出。
2、預冷的酒精溶液具有以下優點:
（1）抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解。
（2）降低分子運動易于形成沉淀析出。
（3）低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。
【例1】關于DNA粗提取與鑒定實驗的有關說法中正確的是（ ）
A.充分理解DNA的鹽溶液是0.14mol/L的NaCl溶液
B.實驗中提取較純凈的DNA利用了DNA不溶于酒精的特點
C.對最后提取出的DNA用二苯胺試劑鑒定時不需要加熱
D.實驗操作過程中先后兩次加入蒸餾水的作用相同
【解析】DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小。提取較純凈的DNA時可加入95%的冷卻的酒精，由于DNA不溶于酒精，DNA會從溶液中析出。DNA溶液中加入二苯胺試劑加熱后才會變成藍色。實驗操作中先后兩次加入蒸餾水的作用不相同，第一次加入蒸餾水是使細胞吸水脹破，釋放出核物質，第二次加入蒸餾水是降低NaCl濃度，使DNA析出。
【答案】B。
【感悟高考真題】
（2010?廣東高考）22.新技術的建立和應用對生物學發展至關重要。下列技術（或儀器）與應用匹配正確的是
A.PCR技術??擴增蛋白質
B.雜交瘤技術??制備單克隆抗體
C.光學顯微鏡??觀察葉綠體的基粒
D.花粉離體培養??培育單倍體植物
【解析】本題主要考查學生的理解能力。PCR技術只能用來擴增核酸，不能用來擴增蛋白質；利用光學顯微鏡無法觀察到葉綠體。
【答案】BD
（2010?江蘇高考）32．(7分)某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關探究活動。具體步驟如下：
材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份．每份l0 g。剪碎后分成兩組，一組置于20℃、另一組置于一20℃條件下保存24 h。
DNA粗提取：
第一步：將上述材料分別放人研缽中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過濾．
取濾液備用。
第二步：先向6只小燒杯中分別注人10mL濾液，再加人20 mL體積分數為95％的冷酒精
溶液，然后用玻璃棒緩緩地向一個方向攪拌，使絮狀物纏繞在玻璃棒上。
第三步：取6支試管，分別加入等量的2 mol／L NaCl溶液溶解上述絮狀物。
DNA檢測：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑�；旌暇鶆蚝�，置于沸水中加熱5 min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺,結果如下表。
分析上述實驗過程，回答下列問題：
(1)該探究性實驗課題名稱是 ▲ 。
(2)第二步中”緩緩地”攪拌，這是為了減少 ▲ 。
(3)根據實驗結果，得出結論并分析。
①結論1：與20℃相比，相同實驗材料在-20℃條件下保存，DNA的提取量較多。
結論2： ▲ 。
②針對結論I．請提出合理的解釋： ▲ 。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白質變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對DNA影響極小。為了進一步提高DNA純度，依據氯仿的特性．在DNA粗提取第三步的基礎上繼續操作的步驟是： ▲ 。然后用體積分數為95％的冷酒精溶液使DNA析出。
【解析】本題考查了DNA粗提取技術的原理、操作過程及同學分析、判斷能力，從題目實驗看出，該實驗的課題是探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響。在試用第二步中，為了防止DNA斷裂，要緩緩的攪拌，從表中結果看出，由于低溫抑制了相關酶的活性，DNA降解慢，使得相同材料在低溫保存下，DNA提取量大，在相同條件先，蒜黃藍色最深，說明相同條件下從蒜黃中提取的DNA量最大，由于氯仿密度比水大，可使蛋白質變性后沉淀，而與水、DNA不相溶，這樣可將第三步獲得的溶液與等量的氯仿混合，靜置一段時間，吸取上清液即可得到較純凈的DNA。
【答案】（1）探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響
（2）DNA斷裂
（3）①等質量的不同實驗材料，在相同的保存溫度下，從蒜黃提取的DNA量最多
⑦低溫抑制了向光酶的活性，DNA降解速度慢
（4）將第三步獲得的溶液與等量的氯仿充分混合，靜置一段時間，吸取上清液
（2009?江蘇高考）23．下列關于DNA和蛋白質提取與分離實驗的敘述，正確的有
A．提取細胞中的DNA和蛋白質都需用蒸餾水漲破細胞
B．用不同濃度NaCl溶液反復溶解與析出DNA可去除蛋白質
C．蛋白質提取和分離過程中進行透析可去除溶液中的DNA
D．蛋白質和DNA都可以用電泳的方法進行分離純化
【解析】A選項，在提取DNA時，如果是用動物的細胞需要用蒸餾水漲破，如果用植物細胞則不需要，而是用洗滌劑溶解細胞膜；用2 mol／L的NaCl溶液溶解DNA，然后過濾出蛋白質，再降低NaCl溶液的濃度，析出DNA。DNA和蛋白質樣品都是帶負電荷的，從負極向正極移動，移動的距離都和樣品的分子量有關。C中透析用以出去小分子物質，DNA是大分子物質，D是常規方法比如用十二烷基磺酸鈉，可以根據其分子大小及所帶電荷性質進行分離純化
【答案】BD
（2008?江蘇高考）下列敘述中錯誤的是
A．改變NaCl溶液的濃度只能使DNA溶解而不能使其析出
B．在沸水浴中，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色
C．用電泳法可分離帶電性質、分子大小和性狀不同的蛋白質
D．用透析法可去除蛋白質樣品中的小分子物質
【解析】當NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時，隨濃度升高，DNA的溶解度升高；NaCl溶液濃度為0.14mol/L時，DNA的溶解度最低。因此，改變NaCl溶液的濃度可以使其析出。
【點評】本題考查生物大分子DNA和蛋白質分離的有關知識，屬于識記層次。
【答案】A。
【考點精題精練】
1.在制備雞血細胞液的過程中，加入檸檬酸鈉的目的是（ A ）
A.防止凝血 B. 加快DNA析出 C. 加快DNA溶解 D. 加速凝血
2.關于“DNA粗提取和鑒定”的實驗原理的敘述中，正確的是 C
A．用豬血為實驗材料的原因是豬血的紅細胞有細胞核，DNA含量多
B．利用 DNA 在2mol/L的氯化鈉溶液中溶解度最低，易析出的特性提取DNA
C．利用 DNA 不溶于酒精，而細胞中的其他物質可溶于酒精的特性提純DNA
D．利用DNA與二苯胺作用而顯現紫色的特性鑒定DNA
3.在DNA粗提取與鑒定實驗中，將獲得的含有DNA的黏稠物(含較多物質)分別處理如下 C
①放入2mol／L的氯化鈉溶液中，攪拌后過濾，得到黏稠物A和濾液a；
②放入O.14 mol／L的氯化鈉溶液中，攪拌后過濾，得到黏稠物B和濾液b；
③放入冷卻的95％的酒精溶液中，攪拌后過濾，得到黏稠物C和濾液c。
以上過程獲得的濾液和黏稠物中，因為只含有少量DNA而可以丟棄的是
A．AbC B．ABc C．Abc D．abc
4.（2010?江蘇省鹽城市高三第二次凋考）在“DNA的粗提取和鑒定”實驗中，甲、乙、丙、丁四個小組除下表中所列處理方法不同外，其他操作步驟均正確，但實驗結果卻不同。下列有關敘述不正確的是 D
A．實驗材料選擇錯誤的組別是丙
B．沸水浴后試管中溶液顏色變藍的組別是甲、丁
C．甲組實驗現象差的原因是25℃的酒精對DNA的凝集效果差
D．乙組實驗不成功僅因為在鑒定時加入了雙縮脲試劑
5.關于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的敘述不正確的是（ABC）
A．隨著NaCl溶液濃度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大
B．隨著NaCl溶液濃度的減小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也減小
C．DNA在NaCl溶液中的溶解度與NaCl溶液的濃度無關
D．當NaCl溶液的濃度為0.14mol/L時，DNA的溶解度最低
6.下列關于DNA粗提取與鑒定的說法不正確的是（ABC）
A．洗滌劑能瓦解細胞膜，同時也能控制DNA在NaCl溶液中的溶解度
B．在探究洗滌劑對植物細胞DNA提取的影響實驗中，需要控制的變量是洗滌劑和植物細胞
C．常溫下，DNA遇二苯胺被染成藍色
D．將濾液放在60～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15分鐘能去除濾液中的雜質，其原理是利用了DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同
7.關于PCR的說法不正確的是 （ C ）
A、PCR是體外復制DNA的技術 B、Taq酶是一種熱穩定DNA聚合酶
C、PCR過程中只需要兩個引物分子 D、PCR利用的是DNA雙鏈復制原理
8.（09-10?遼寧省開原高中高二下第一次月考）多聚酶鏈式反應（PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。PCR過程一般經歷下述三十多次循環：95℃下變性（使模板DNA解旋）→55℃下復性（引物與DNA模板鏈結合）→72℃下延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關PCR過程的敘述中不正確的是 C
A.變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現
B.復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成
C.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸
D.PCR與細胞內DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高
9.PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。PCR過程一般經歷下述三十多次循環：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55℃下復性（引物與DNA模板鏈結合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關PCR過程的敘述中不正確的是 （ C ）
A．變性過程中破壞的是DNA分子內堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現
B．復性過程中引物與DNA模板鏈的結合是依靠堿基互補配對原則完成
C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸
D．PCR與細胞內DNA復制相比所需要酶的最適溫度較高
10.凝膠色譜法是根據（ B ）分離蛋白質的有效方法。
A.分子的大小 B.相對分子質量的大小 C.帶電荷的多少 D.溶解度
11.相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的進行過程可表示為圖中哪一個 B
12.洗滌紅細胞屬于血紅蛋白提取和分離的 B
A粗分離 B 樣品處理 C純化 D 純度鑒定
13.下列有關提取和分離血紅蛋白的程度敘述錯誤的是 B
A．樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液
B．通過透析可以去除樣品中分子質量較大的雜質，此為樣品的粗提取
C．可通過凝膠色譜法將相對K考S資5源U網分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化
D．可通過SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度
14.在血紅蛋白分離過程中，如果紅色帶區歪曲、散亂、變寬，與其有關的是 B
A凝膠色譜柱的制作 B色譜柱的裝填 C洗脫過程 D樣品的處理
15.下列那項蛋白質的性質會影響到蛋白質的泳動速度(ACD)
A．蛋白質分子的大小 B．蛋白質分子的密度
C．蛋白質分子的形狀 D．蛋白質分子的等電點
16.蛋白質提取和分離一般分為哪幾步（ACEF）
A．樣品處理 B．凝膠色譜操作 C．粗分離
D．SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 E．純化 F．純度鑒定
17.在蛋白質的提取和分離中，關于對樣品處理過程中，分析正確的是 D
A．洗滌紅細胞的目的是去除血漿中的葡萄糖、無機鹽
B．洗滌時離心速度過低，時間過短，白細胞等會沉淀，達不到分離的效果
C．洗滌過程選用0.1％的生理鹽水
D．透析的目的是去除樣品中相對分子質量較小的雜質
18.下列有關蛋白質的分離與提純的敘述不正確的(AC)
A．蛋白質分子的等電點不會影響到蛋白質的泳動速度
B．能夠分離蛋白質的方法有透析法等
C．如果要分離與純化血紅蛋白，用到的抽提劑是堿性溶液
D．根據血清蛋白醋酸纖維薄摸電泳圖譜示意圖可知血清中含量最多的成分是清蛋白
19.（2010?江蘇省南通、揚州、泰州三市高三二模）
下圖是“DNA粗提取與鑒定”相關實驗步驟，請據圖分析回答：
（1）雞血細胞是進行該實驗較好的實驗材料，這是因為_________________________。從雞血細胞中釋放出核物質的處理方法是_________________________。
（2）圖a表示釋放核物質后進行過濾的過程，過濾后取 進行下一步實驗。
（3）圖b表示的相關操作過程中，加入2mol/LNaCl溶液的作用是 。
（4）圖c表示在濾液中加入冷卻的95%的酒精，其目的是__________________________。
答案：（5分）
（1）雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得（以及雞血細胞極易吸水脹破） 向雞血細胞中加入蒸餾水，并攪拌
（2）濾液
（3）溶解DNA分子
（4）提取雜交更少DNA（或去除脂溶性雜質）
20.DNA在NaCl溶液中溶解度有二重性，隨著NaCl溶液的變化而變化。
（1）請在下列NaCl溶液中選出溶解度能使DNA析出最徹底的一種（ ）和溶解度最高的一種（ ）
A. 0.14mol/l B. 2mol/l C. 0.15mol/l D. 0.3mol/l
（2）DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些物質卻可以溶于酒精溶液，利用這一原理可以____________，可以推測溶于酒精中的物質可能有____________。
（3）利用DNA與_____變藍色的特性，將該物質作為鑒定______的試劑。其實驗過程要點是向放有_____的試管中加熱4ml的____。混合均勻后，將試管置于___5min，待試管______，觀察試管中溶液顏色的變化，這個實驗也說明DNA耐___溫。
【答案】（1）A；B
（2）除去雜質；某些脂類、蛋白質、糖類或其他大分子物質
（3）二苯胺；DNA；DNA；二苯胺試劑；沸水中水浴加熱；冷卻后；高
21.資料顯示，近十年來，PCR技術（DNA聚合酶鏈式反應技術）成為分子生物實驗的一種常規手段，其原理是利用DNA半保留復制的特性，在試管中進行DNA的人工復制（如下圖），在很短的時間內，將DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使分子生物實驗所需的遺傳物質不再受限于活的生物體。請據圖回答：
（1）加熱至94℃的目的是使DNA樣品的 鍵斷裂，這一過程在生物體細胞內是通過 酶的作用來完成的。通過分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，這個事實說明DNA分子的合成遵循 。
（2）新合成的DNA分子與模板DNA分子完全相同的原因是
和 。
（3）通過PCR技術使DNA分子大量復制時，若將一個用15N標記的模板DNA分子（第一代）放入試管中，以14N標記的脫氧核苷酸為原料，連續復制到第五代時，含15N標記的DNA分子單鏈數占全部DNA總單鏈數的比例為 。
（4）PCR技術不僅為遺傳病的診斷帶來了便利，而且改進了檢測細菌和病毒的方法。若要檢測一個人是否感染了艾滋病病毒，你認為可以用PCR擴增血液中的（ ）
A．白細胞DNA B．病毒蛋白質 C．血漿抗體 D．病毒核酸
答案：（1）氫， 解旋， 堿基互補配對原則。
（2）DNA分子中獨特的雙螺旋結構(或以模板DNA分子的一條鏈為模板進行半保留復制) 復制過程中嚴格遵循堿基互補配對原則。
（3）1/16 。 （4） D
22.（2010?寧夏銀川一中高三二模）PCR技術是把一DNA片段在體外酶的作用下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用它能快速而特異地擴增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本過程如下圖所示：
圖中 表示每次擴增過程中需要的引物（加入足夠多）。每個引物含20個核苷酸，并分別與DNA片段兩端堿基互補，其作用是引導合成DNA子鏈，還作為子鏈的一部分，不會從模板鏈上脫落下來，
(1)PCR技術的原理是模擬生物體內的 過程。
(2)PCR擴增過程中需要對DNA片段進行高溫處理，其目的是 ，此過程在生物體內需 酶的參與，作用部位是DNA的 鍵。
(3)據圖分析，擴增過程中需要的引物有 種，其實質是 ，假如引物都用3H標記，從理論上計算，所得DNA分子中含有3H標記的占 。
(4)假定DNA片段含200對脫氧核苷酸，經3次擴增，從理論上計算還需要提供 個游離脫氧核苷酸。
答案：（除特別標注外，其它每空1分）
(1)DNA復制
(2)使DNA的兩條鏈彼此分開(或解旋) 解旋 氫
(3)兩 單鏈DNA 100％ (2分) (4)2520（2分）
23.紅細胞含有大量的血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關問題：
（1）血紅蛋白提取和分離的程度可分為四步：______、______、______和______。
（2）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。
①加入檸檬酸鈉的目的是_____。②該過程即樣品處理，它包括____、_____、收集血紅蛋白溶液。
（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經過透析，這就是樣品的粗分離。
①透析的目的是__________________。②透析的原理是______________________________。
（4）然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，最后經SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。
①樣品純化的目的是______________________________。
②血紅蛋白有什么特點？_____________。這一特點對進行蛋白質的分離有什么意______。
答案：（1）樣品處理；粗分離；純化；純度鑒定（2）①防止血液凝固紅細胞的洗滌，血紅蛋白的釋放（3）①去除分子質量較小的雜質②透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內（4）①通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去②血紅蛋白呈現紅色，在凝膠色譜分離時，可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液②使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。
24.紅細胞含有大量血紅蛋白，紅細胞的機能主要是由血紅蛋白完成。我們可以選用豬、牛、羊等動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關問題：
（1）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。
①其中加入檸檬酸鈉的目的是 。
②此過程即是樣品處理，它應包括紅細胞洗滌、 、分離血紅蛋白溶液。
③洗滌紅細胞的目的是 。
（2）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中透析，這就是樣品的粗分離。
①透析的目的是 。
②透析的原理是 。
（3）然后通過凝膠色譜法將樣品進一步純化，其目的是 最后經SDS?聚丙烯酰胺凝膠電脈進行純度鑒定。
答案：（每空1分，共6分）
（1）①防止血液凝固（1分）；②血紅蛋白的釋放（1分）；③去除雜蛋白（1分）
（2）去除相對分子質量較小的雜質（1分）；
透析袋能使小分子自由進出，而大分子則保留在袋內（1分）
（3）通過凝膠色譜法去除相對分子質量較大的雜質（1分）
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