1．培養基的概念、種類及營養構成
(1)概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出的供其生長繁殖的營養基質。
(3)營養構成：各種培養基一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽，此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。
2．無菌技術
(1)關鍵：防止外來雜菌的入侵。
(2)具體操作
①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。
②將用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等進行滅菌。
③為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。
④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸。
(3)消毒和滅菌
| 消毒 | 滅菌 | |
| 概念 | 使用較為溫和的物理或化學方法殺死物體表面或內部的部分微生物（不包芽孢和孢子） | 使用強烈的理化因素殺死物體內外所用的微生物（包括芽孢和孢子） |
| 常用方法 | 煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學藥劑消毒法、紫外線消毒法 | 灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌 |
| 適用對象 | 操作空間、某些液體、雙手等 | 接種環、接種針、玻璃器皿、培養基等 |
4、接種方法：平板劃線法和稀釋涂布法。
（1）平板劃線操作：
①挑取他含菌樣品：選用平整、圓滑的接種環，按無菌操作法挑取少量菌種。
②劃A區：將平板倒置于煤氣（酒精）燈旁,左手拿出皿底并盡量使平板垂直于桌面，有培養基一面向著煤氣燈（這時皿蓋朝上，仍留在煤氣燈旁)，右手拿接種環先在A區劃3?4條連續的平行線(線條多少應依挑菌量的多少面定）。劃完A區后應立即燒掉環上的殘菌，以免因菌過多而影響后面各區的分離效果。在燒接種環時，左手持皿底并將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內)，以防止雜菌的污染。
③劃其他區：將燒去殘菌后的接種環在平板培養基邊緣冷卻一下，并使B區轉到上方，接種環通過A區（菌源區）將菌帶到B區，隨即劃數條致密的平行線。再從B區作C區的劃線。最后經C區作D區的劃線，D區的線條應與A區平行，但劃D區時切勿重新接觸A、B區，以免極該兩區中濃密的菌液帶到D區，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環上的殘菌。
④等平板凝固后，將平板倒置。
（2）稀釋涂布法：是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，在適宜條件下培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落。能夠測定樣品中活菌數的方法是：稀釋涂布平板法。
純化大腸桿菌的無菌操作和菌種保存：
1．大腸桿菌
(1)特性：革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。
(2)用途：是基因工程技術中被廣泛采用的工具。
2．制備牛肉膏蛋白胨固體培養基
(1)計算：依據是培養基配方的比例。
(2)稱量：牛肉膏比較黏稠，可同稱量紙一塊稱取。牛肉膏和蛋白胨易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。
(3)溶化：牛肉膏和稱量紙+水加熱取出稱量紙→加蛋白胨和氯化鈉→加瓊脂（注意：要不斷用玻璃棒攪拌，防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂）→補加蒸餾水至100mL。
3.純化大腸桿菌
（1）方法
①平板劃線法：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。
②稀釋涂布平板法：將駿業進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。
（2）鑒定：將接種后的培養基和一個未接種的培養基（對照組）都放入到37℃恒溫箱中，培養12h和24h后，分別觀察并記錄結果。
（3）菌種保存
| 臨時保存法 | 甘油管藏法 | |
| 適用對象 | 頻繁使用的菌種 | 長期保存的菌種 |
| 培養及類型 | 固體斜面培養基 | 液體培養基 |
| 溫度 | 4℃ | -20℃ |
| 方法 | 菌落長成后于冰箱中保存，每3～6個月將菌種從舊的培養基轉移到新鮮培養基上 | 將培養的菌液與等體積滅菌后的甘油混合均勻后于冷凍箱內保存 |
| 缺點 | 菌種易被污染或產生變異 | \\ |
知識點撥：
1、無菌技術操作原則：
（1）操作前準備：
①操作環境應清潔、寬敞、定期消毒；物品布局合理；無菌操作前半小時應停止清掃工作、減少走動、避免塵土飛揚。
②工作人員應做好個人準備，戴好帽子、口罩，修剪指甲并洗手，必要時穿無菌衣、帶無菌手套。
（2）操作中保持無菌
①工作人員應面向無菌區，手臂應保持在腰部或操作臺臺面以上，不可跨越無菌區避免面對無菌區談笑、咳嗽、打噴嚏。
②用無菌持物鑷取用物品；無菌物品一經取出，即使未用，也不可放回無菌容器內；一套無菌物品僅供一位患者使用，避免交叉感染。 ③無菌操作中，無菌物品疑有污染或已被污染，應予更換并重新滅菌。
（3）無菌物品保管：
①無菌物品必須與非無菌物品分開放置。
②無菌物品不可暴露于空氣中，應存放于無菌包或無菌容器中，無菌包外須標明物品名稱、滅菌日期，并按失效期先后順序排放。
③定期檢查無菌物品的滅菌日期及保存情況。無菌包在未被污染的情況下保存期一般為7天，過期或受潮應重新滅菌。
2、劃線分離操作中的有關問題：
（1）在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環，在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環。
| 第一次灼燒 | 每次劃線之前灼燒 | 劃線結束灼燒 | |
| 目的 | 避免接種環上可能存在的微生物污染培養基 | 殺死上次劃線結束后接種環上殘留的菌種 | 殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染或感染操作者 |
③在進行第二次以及其后的劃線操作時'要從上一次劃線的末端開始劃線。每次劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
(2)進行恒溫培養時，要將培養皿倒置的原因如果正放培養皿，則皿蓋上形成的水滴會落入培 養基表面并且擴散開。如果培養皿中已形成菌落，則茵落中的細菌會隨水擴散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達不到分離的目的。因此恒溫培養時，培養皿必須倒置。
(3)培養后判斷是否有雜菌污染的方法
①從菌落的形態看，是否濕潤、透明、黏稠，呈何種顏色等等，是區別細菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關鍵指標。
②用顯微鏡鏡檢觀察其形態、大小，看是否有菌絲、孢子、芽孢等，這也是區別細菌、酵母菌、放線菌和霉菌的關鍵指標。
知識拓展：
1、對異養微生物來說，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作為營養要素成分時并不是起單一方面的作用。
2、并不是所有微生物都需添加特殊營養物質，有些微生物需添加，原因是它們自身缺乏合成這些物質所需要的酶或合成能力有限。
3、含抗生素的牛奶不能發酵為酸奶的原因：牛奶發酵成酸奶是利用乳酸菌來完成的，乳酸菌屬于細菌，
4、化學藥劑的消毒方法，其作用原理是使細菌體內蛋白質變性，但是化學物質很難透過孢子或芽孢的堅硬外層進入細胞內，因此化學方法難以消滅孢子和芽孢。
5、體積分數為70%的乙醇殺菌效果最強，濃度過低，殺菌力弱，濃度過高，使菌體表面蛋白質凝固形，成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其內，因此殺菌效果受影響。
6、倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住管（瓶）塞（也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中）。左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速例入培養基約15mL，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。
7、在斜面培養基上接種時，其正確的操作順序：
①用左手大拇指、食指和無名指夾住菌種試管和待接種的斜面試管，管口并齊，使斜面向上成水平狀態
②右手擰松棉塞，但不取下
③右手拿接種環，在火焰上灼燒滅菌
④在火焰邊用右手無名指和小指夾兩個棉塞，將它們取下，同時左腕轉動，灼燒管口一周
⑤將接種環伸入管內，讓環先接觸培養基上未長菌的部位，使環冷卻，然后輕輕挑取少量菌體
⑥在火焰旁邊迅速將沾有菌體的接種環伸到培養基的底部，由里向外輕輕畫蛇形細線
⑦抽出接種環，再用火焰灼燒管口，并在火焰上方將棉塞塞上
8、自養型微生物與異養型微生物的培養基的主要差別在于碳源。
9、平菇培養的操作程序：配制棉籽殼培養基，高壓蒸汽滅菌，接種，培養。
10、菌種的保存：對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法；臨時保藏的菌種一般是接種到試管的固體斜面培養基上；臨時保藏的菌種容易被污染或產生變異；在臨時保藏過程中，每3～6個月都要重新將菌種從舊的培養基上轉移到新鮮的培養基上；
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